Molekulyar Genetik tədqiqat metodu

araşdırmaq və DNT strukturu istifadə molekulyar genetik üsulla variantlar müəyyən etmək. xromosom, gen və ya allel bu regiona araşdırır hər DNA rayonunun üçün, metodları fərqlənir. hər molekulyar genetik metodu əsas bəzi və ya RNT və DNT digər manipulyasiya ibarətdir. laboratoriya şərait həyata keçirilə bilməz olmadan bütün bu üsulları böyük mürəkkəbliyi ilə xarakterizə olunur, və heyət yüksək ixtisaslı olmalıdır. Bu iş bir neçə mərhələdə həyata keçirilir.

mərhələləri

Birincisi, RNT və ya DNT nümunələri çıxarılacaq. Burada bir molekulyar genetik üsul faktiki olaraq hər hansı bir material tətbiq edilə bilər: qan, leykositlərin bir damla, mədəniyyət fibroblasts, mukoza (həkk), hətta saç köklərinə, - DNA hər hansı bir nümunə əldə edə bilərsiniz. Hər hansı bir molekulyar genetik üsullar və onların müxtəlif variantları istifadə üçün uygundur və uzun təcrid DNT dondurulmuş saxlanılır var. Bu (orqanizmin həyat iştirakı olmadan vitro) vitro polimeraza zəncirvari reaksiya təmin edir kimi ikinci mərhələ, DNT istədiyiniz fraqmentləri (amplification) toplanması həsr olunur. Nəticədə, bu zəncirvari reaksiya seçilmiş DNA parçasının multiplies və DNA artır dəfə sözün milyonlarla məbləği.

molekulyar genetik tədqiqat metodları üçüncü addım vurulur DNA məhdudiyyət (bu parçalanma, qoparmaq və ya kəsici) ehtimal edilir. Məhdudlaşdırılması bir poliakrilamid ya agarose gel haqqında elektroforez tərəfindən həyata keçirilir. DNA parçası oxuyan bu molekulyar-genetik üsul hər kəs gel müəyyən mövqe tutmağa imkan verir. Bundan sonra gel ethidium brom ilə müalicə olunur, DNT məcburi bilən ultrabənövşəyi işıq şüalarının, o lüminessensiya hissəsini müşahidə etmək mümkündür. Molekulyar Genetik diaqnostik üsulları müxtəlif və çoxsaylı, lakin ilk iki addım bütün eynidir. Amma DNT fraqmentləri müəyyən etmək üçün, gel mövcud olan digər üsulları rəngli və bir çox ola bilər.

növ

aşkar mkobakteryaların üçün ən birbaşa və geniş yayılmış üsulları yuxarıda molekulyar genetik DNA öyrənmə metodu daxil ola bilər. Onun mahiyyəti ki, patogenlər DNT xüsusi fraqmentləri scan zəncir maddi müəyyən etmək üçün. Molekulyar Genetik diaqnostika üsulları hələ vərəm kimi xəstəliklərin tanımaq üçün daha səmərəli yol yoxdur. polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) istifadə edərək, siz orijinal DNA, ki, bir milyon dəfə nüsxə sayı artacaq amplification olacaq, və bu nəticələri göstərilir ki, arxayın ola bilərsiniz. Bu metodun əsas üstünlüyü doxsan beş faiz, daha çox - həssaslıq səviyyəsi çox yüksəkdir.

Bu halda hazırlanması nümunə xüsusi oligonucleotide ardıcıllıqla yüz altı dəfə artıb göstərir bəri gəlir çox nüsxə effektivliyi haqqında araşdırma molekulyar-genetik üsullar qalan sanki iki dəfə. tənəffüs sistemi vərəm Hətta mədəniyyət diaqnoz əhəmiyyətli dərəcədə həssaslıq aşağı. müasir tibb vərəm diaqnozu molekulyar genetik üsulları əsaslanır görə. A təsvir üsulu yüksək antigenic dəyişkənlik patogenlər ilə məşğul olan digər yol müəyyən xüsusilə çox çətindir effektiv deyil - xüsusi tələb qida media və uzun müddət yetişdirilməsi. Biokimyəvi və molekulyar genetik üsullar nəticələri çox fərqli təsir istehsal edir.

vərəm diaqnozu

vərəm Marshall PCR diaqnoz ən çox xəstəliyin bütün dörd növ xüsusi olan DNA ardıcıllığı istifadə edərək. bu elementlər yüksək köçəri növ Mycobacterium tuberculosis və həmişə genomu mövcud birdən çox kopyasını xarakterizə bu məqsədə nail olmaq üçün tez-tez ardıcıllıqla elementləri (IS-986 IS-6110) IS aşkar astar istifadə edin. Həmçinin DNA hasilatı hər hansı digər münasib üsulla təmiz mədəniyyətlər və Klinika (xəstələr bəlğəm) həyata keçirilə bilər. Məsələn, lizisi bufer daşıyıcısı DNT kimi guanidine Thiocyanate və silisium əsasında orada Boom üsulu istifadə olunur. hər il artan zəif bakterioloji fərqlənir və buna görə də klinik təşkilatın başqa səviyyədə müəyyən xəstələrin sayı: DNT öyrənilməsi molekulyar-genetik metodu diaqnoz böyük rol oynayır.

Lakin, biz bu çatışmazlıqlar olmadan deyil ki, etiraf etmək lazımdır. PCR metodu tez-tez istifadə yalan-müsbət nəticələr bir çox gətirir və səbəb deyil, yalnız texniki səhvlər, həm də metodu özü xüsusiyyətləri. Bundan əlavə, müəyyən edilmişdir mkobakteryaların, mümkünlüyünü müəyyən etmək üçün diaqnoz bu metodu istifadə edərək, sadəcə mümkün deyil. Lakin bu çatışmazlığı ən əhəmiyyətli deyil. PCR diaqnostika molekulyar genetik üsullar mkobakteral DNT çirklənmə riskini səbəb. Bu səbəblə Certification tələblər PCR laboratoriyaları üçün xüsusi ağır nəzərdə ki, onlar üç ayrı binalar tələb edir. PCR texnologiyası müvafiq avadanlıq və yüksək təlim keçmiş personal istifadə tələb, müasir və çox mürəkkəbdir.

bakterioskopiyanın

analiz diaqnoz nəticəsində digər məlumatları ilə müqayisədə mütləq zaman: klinik müayinə, rentgenoqrafiya, böhtan mikroskop, məhsul və xüsusi müalicə hətta cavab çox vacibdir. Bu sıra, PCR tədqiqatlar yalnız komponentlərindən biridir. bakterioloji - sadə və qısa üsulları ola bilər erkən diaqnoz patogen aşkar.

yüngül (Ziehl-Neelsen boyayıcı) mikroskop və fluorescent (boyayıcı fluorochromes) var istifadə olunur. üstünlüyü nəticələri qaralama sürəti. Amma onun günah doğru aşağı həssaslıq məhdud gücü hesab olunur. Lakin bu üsul ən iqtisadi və vərəm xəstələrin aşkar etmək üçün əsas kimi ÜST tövsiyə verilir. mycobacteria bakterioloji üsulla aşkar proqnozlaşdırılması dəyəri və təxmin kəmiyyət bakterial ifraz var. Daha çox inamlı vərəm Bu molekulyar genetik tədqiqat metodları ilə məşğul.

Cultures

mkobakteryaların daha yaxşı aşkar mədəni tədqiqatlar tanımalıdır. Bu yumurta orta daxil edilir patoloji material əkin: Mordovsky, Finn II, LJ, və s. vitro dərman və mkobakteryaların bir sıra səmərəliliyinin dolayı sübut və onların koloniyaları mkobakteryaların müqavimət Dərəcələr, tədqiqat mədəniyyət tətbiq üsulu əgər. Çox mühit keçirilir patoloji material mycobacteria peyvənd təcrid faiz artırmaq.

çox mədəni, patogen o cümlədən qrant və mayelərin ehtiyaclarını ödəmək. Bu sistem istifadə və avtomatlaşdırılmış ölçü növü VANTES artım. Bitkilər yeddi səkkiz həftə üçün inkubasiya keçirilməlidir. Bu zaman artım olmaması ilə məhsul mənfi hesab edilə bilər. TB üçün son dərəcə həssas diaqnostik material bulaşmaz Qvineya donuz, Mycobacterium vərəm aşkar etmək üçün ən effektiv yolu bioloji nümunələri hesab edir.

Bəzi rəqəmlər

gizli infeksiya - PCR diaqnostika açdı təhsil Maraqlı sahədə M. vərəm öyrənmək idi. TB infeksiya müasir anlayışı M. vərəm ilə əlaqə idi yüz adamdan doxsan bilərsiniz yaxşı yoluxmuş ola, lakin onların yalnız on fəal xəstəlik inkişaf edir ki, göstərir. Digərləri TB toxunulmazlıq var və hallarda doxsan faizi çünki infeksiya gizli qalır. bir model aşkar bir molekulyar genetik üsul kömək etmişdir.

Genetik kimin bitkilər patoloji material mənfi idi, M. vərəm yoluxmuş insanların səksən faizi, lakin xəstəliyin heç bir rentgenoqrafik təzahürləri ilə axan o əlli beş faizi, PCR müsbət reaksiyalar aldıqlarını deyirlər. Bu mənfi onların təhlili (mikroskopiyası və mədəniyyət) nəticələri ilə, PCR işlər risk xəstələr müəyyən etmək kömək edən genetik diaqnostik üsul idi və subklinik infeksiya M. tuberculosis hazır oldu.

müasir tədqiqat

Griess reagent test mkobakteryaların nitrat redüktaz fəaliyyəti: Rusiya Federasiyası və bakterioloji laboratoriyalar mütləq konsentrasiyaları sürətli metodu istifadə edin. Anti-TB mərkəzləri narkotik müqavimət müəyyən etmək üçün imkan verir ki, metodu istifadə edin. mkobakteryaların radiometrik və fluorescent uçot sistemi artım avtomatlaşdırılmış maye media Bu əkin. Belə bir analiz tez edilir - up iki həftə.

Hal-hazırda, yeni üsullar inkişaf etdirilir: mkobakteryaların narkotik müqavimət genotip səviyyəsində qiymətləndirilir. müqavimət genlərinin molekulyar mexanizmləri və öyrənilməsi mkobakteryaların iştirakı göstərir. Bu gen xüsusi narkotik müqavimət ilə bağlıdır. Məsələn, Kasa gen, Inha üçün katG izoniazid, rpoB gen davamlı - rifampisin 16Sp RNT gen və rpsL - streptomisinin, emb1 - etambutol, Gyra üçün - belə florxnolonlara və.

mutasiyalar

müasir diaqnoz əhəmiyyətli DNT öyrənilməsi üçün molekulyar-genetik səviyyədə metodu artıb və bütün spektri mutasiyalar genişmiqyaslı işlər həyata keçirmək üçün icazə. İndi biz ən ümumi 516, 526 və 531 codons mutasiyalar rpoB gen, və müxtəlif narkotik müqavimət müəyyən bilirik. Orada yalnız ənənəvi üsullardan istifadə mkobakteryaların bir yazaraq metodlarının bir sıra var - biokimyəvi bioloji və mədəni, həm də geniş müasir molekulyar genetik üsulları istifadə olunur. Artıq adekvat və monogenic xəstəliklərin aşkarlanması üçün doğru diaqnoz üsulu təmin edir. Onlar xüsusi gen dəqiq sahəsində DNT tədqiqatlar əsaslanır. Bu adətən bir mürəkkəb prosesdir vaxt aparan və bahalı, lakin molekulyar genetik analiz tərəfindən təmin edilir data, daha dəqiq və informativ bütün digər analizlərin məlumatlar çoxdur.

Bu uzun DNT hər hansı bir nucleated hüceyrələri odnakova ki orqanizmin bütün həyat üçün dəyişmir ki, məlum və bu mümkün ontogeny istənilən mərhələsində, bədənin tamamilə bütün hüceyrələri təhlili almaq üçün edir edilmişdir. zədələnmiş gen tam miqyaslı klinik xəstəlik ilk simptomları görünüşünü, eləcə də sağlam heteroziqot xalqı qarşısında aşkar, lakin gen bir mutasiya malik ola bilər. Molekulyar Genetik irsi xəstəlik diaqnostik üsulları, onun (birbaşa yanaşma, DNA-diaqnostika) aşkar, eləcə də yaxından zədələnmiş gen (yəni, DNA-diaqnostika dolayı yanaşma) ilə bağlıdır marker loci DNT (genetik polymorphisms) ilə ailə xəstəliyin təcrid təhlil imkan verir. Birbaşa və ya dolayısı - Hər hansı bir DNA diaqnostika insan DNT-ciddi müəyyən hissəsini müəyyən üsulları əsaslanır.

birbaşa üsulları

DNA diaqnoz birbaşa üsulları günahkar gen irsi xəstəlik kimi tanınmış, məlum olduqda və onun mutasiyaların növləri. Məsələn, bir sıra xəstəliklər bir uyğun birbaşa üsulları. Bu Huntington rəqs (davamı CTG-təkrar), fenilketonüri (R408W), kistik fibroz (delF508 böyük mutasiyalar) və s. Birbaşa metodun əsas üstünlüyü tam mülkiyyətində olan diaqnostik dəqiqlik və ailə istirahət DNT analiz etmək üçün heç bir ehtiyac yoxdur. müvafiq gen bir mutasiya aşkar olunarsa, bu, məhz yükü altında qalıblar ailə istirahət üçün irsiyyət, genotip müəyyən edilməsi diaqnozu təsdiq etməyə imkan verir.

birbaşa diaqnoz bir üstünlüyü xəstəlikdən vəfat qohumları və valideynlərin pis mutasiyalar bir heteroziqot daşıyıcısı müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulur. xəstəliklər resessiv Otozomal üçün xüsusilə doğrudur. birbaşa üsulları Dezavantajları də var. onlara müraciət etmək üçün, dəqiq bilmək onun spektri və mutasiyaların anormal gen, exon-Intron strukturu lokallaşdırılması lazımdır. bütün monogenic xəstəlikləri gün belə məlumat aldıq deyil. bir və eyni gen irsi xəstəliklərin inkişafına səbəb olur patoloji mutasiya bir çox ola bilər, çünki Informativeness birbaşa üsulları, tam hesab edilə bilməz.

dolayı metodları

DNA diaqnostikasında dolayı metodları zədələnmiş gen müəyyən deyil əgər, digər hallarda, bütün istifadə, lakin yalnız chromosomally, və ya line diaqnoz (gen kompleks molekulyar təşkilat və ya böyük ölçüdə, bir çox var, əgər o, baş nəticə vermədi əgər patoloji mutasiyalar). Dolayı üsulları allelic ailə polimorf markerlər ayırma təhlili çıxış edib. eyni xromosom region və ya mahal aşkar markerlər yaxından xəstəliyi ilə bağlı və əhatəsindədir və ya insertions, point Əvəzedicilərimiz, təkrar təmsil və onların polimorfizmi blok hüceyrələri müxtəlif məbləği ilə bağlıdır olunur.

geniş insan genomu paylanır dolayı diaqnoz hesab Mikrosatellit və minisatellite polymorphisms üçün ən rahat. marker və gen arasında genetik məsafə zərər çox böyük deyil, əgər onların dəyəri, məlumat ehtiva dilə gətirdi. Sonuncu halda, qiymətləndirilməsi dəqiqlik böyük ölçüdə polimorf marker və zərər arasında rekombinasiya tezliyi müəyyən edilir. Dolayı diaqnostik üsulları da məcburi ilkin xəstələr və mutasiyaların daşıyıcıları arasında təhlil əhali təhsil allel tezliklərin addım plus tarazlıqda olmayan və yapışma markerlər və mutant alleller rekombinasiya ehtimalını müəyyən zəruriliyini təmin edir.

digər üsulları

mikroskopik təhsil altında görüntülenmeyecektir RNT və ya DNT qısa seqmentləri, eləcə də bir gen Buna görə də, molekulyar genetik diaqnoz lazım mutasiyalar müəyyən etmək, ola bilməz. Bir "İnsan Genom Layihəsi", eləcə də molekulyar genetika digər avanslar var çox irsi xəstəliklərin diaqnostikası imkanı geniş - pre-və postnatal də. Bu metodlar erkən aşkarlanması və onun debüt yetişkinlik baş verən bir proqnozlaşdırılması poly- və monogenic xəstəlikləri, edə bilərsiniz. Təəssüf ki, molekulyar genetik işlərin texniki imkanlarına görə diaqnoz yeniyetməlik və uşaqlıq xüsusilə, bəzən miras ilə bağlı müəyyən edilir etik hüdudlarından var.

Struktur və ədədi xromosom pozğunluqları xəstəliyi və xərçəng və bir çox qüsurların ən ümumi səbəbləri var. Xromosom aberrasyonları ailə məsləhətçiliyi üçün əhəmiyyətli olan müəyyən etmək lazımdır - gələcək hamiləliklərin reproduktiv risk ilə yanaşı, proqnoz qiymətləndirilməsi. Xromosom analizi genetik diaqnoz "qızıl standart", ancaq məhduddur. Yalnız üsulları molekulyar genetik analiz klassik aşkar etmək üçün mümkün olan incə xromosom dəyişiklikləri müəyyən etmək üçün yüksək həssaslıq bilən texnologiyasına əsaslanan fluorescent yazıları klonlama orada istifadə çünki, daha çox edə bilərsiniz sitogenetik tədqiqatlar. Bu texnika getdikcə diaqnostik imkanları genişlənir, müayinə zaman, bir çox digər irsi xəstəliklərin inkişaf qüsurları, Zəka geriliyi, uşaqlar.

nəticələr

Bu gen quruluşu və bilik funksiyası dəyişkənlik növləri, molekulyar genetika inkişafı ilə əlaqədar meydana gələn irsi xəstəliklərin aşkar etmək imkanı idi insanlıq üçün çox vacibdir. Onun metodları DNT molekulunun öyrənilməsi məqsədi - və bu zaman normal və zədələnmiş zaman. nucleotides (DNT) və dezoksiribonuklein turşusu ardıcıllığı hazırlanması fərdi fraqmentləri müəyyən nümunələri qəbul mərhələdə uzanır. fraqmentləri genom hüceyrələri DNT, məhdudiyyət (qoparmaq), amplification (klonlama) elektroforez izolyasiyası (agarose gel öz elektrik pulsuz və molekulyar çəkisi ayrılması). diskret zolaq səthində yerləşən xüsusi fraqmentləri müəyyənləşdirilməsi.

Sonra klonlaşdırılmış DNA fraqmentləri və ya sintetik radioaktiv probe ilə hər parça hibridləşdirilməsi keçdiyi aktı xüsusi filtreler, nəzərə almaq hər test nümunəsi bərabər olacaq nəzarət edir. Siz zond ilə müqayisədə mövqeyini və ya uzunluğu dəyişdirmək, əgər yeni bir parça və ya yox - bütün bu təhlil gen nukleotid ardıcıllığı yenidən məruz göstərir. molekulyar genetik işlərin səkkiz əsas üsulları var: sequencing (DNA ardıcıllıqla müəyyən) polimeraza zəncirvari reaksiya (ardıcıllığı sayının artması), astar məlum gen hazırlanması, DNA klonlama, rekombinant molekulların səbəbiylə rekombinant molekulların istehsal edilən zülal, bir komplekt yaradılması (kolleksiyası kitabxana) məhdudiyyət istifadə edərək əldə edilmişdir fraqmentləri klonlaşdırılmış.